Rei Ayanami é a primeira filha e piloto da Unidade Evangelion 00. Ela é socialmente retraída e raramente interage com outras pessoas. Sua personalidade fria, silenciosa e emocionalmente abalada faz com que seja desprezada pelos colegas de escola; Asuka a chama de “bonequinha”. Embora esteja principalmente ligada a Gendo, Rei e Shinji conseguem quebrar o gelo depois da batalha contra Ramiel e se aproximam gradualmente por algum tempo. Os clones dela, que não possuem alma, ficam escondidos sob o prédio da NERV para servir como os supostos “núcleos” das Plugs Dummy.

Além disso, a série sugere que Rei morreu duas vezes. Isso deriva do fato de ela dizer: “Eu acho que sou o terceiro”, logo após sua morte quando a Unidade 00 se autodestruiu, um evento que ela não consegue lembrar. O primeiro Rei aparece morrendo como uma menina nas mãos da Dra. Naoko Akagi depois de revelar algo descuidadamente (ou talvez em uma trama intencional por Gendo Ikari) à Naoko, que a chamou de “velha bruxa inútil”. A explicação é que sua alma e a maior parte das memórias são transferidas para um dos clones toda vez que ela morre; assim, o clone assume o lugar do Rei anterior como se ela não tivesse morrido.