Rei Ayanami é a primeira filha de Gendo e piloto da Unidade Evangelion 00. Ela se mostra socialmente retraída e raramente interage com quem lhe rodeia. Sua personalidade fria, silenciosa e emocionalmente abalada atrai o desprezo dos colegas escolares; Asuka a chama de “bonequinha” ou “bonequinha”. Embora esteja ligada principalmente a Gendo, Rei e Shinji conseguem romper o gelo após a batalha contra Ramiel e se aproximam gradualmente ao longo do tempo.

Os clones dela, que não possuem alma, ficam escondidos sob o prédio da NERV para servir como supostos núcleos das Plugs Dummy. Há também a sugestão de que Rei morreu duas vezes na série; isso deriva do fato de ela dizer “Eu acho que sou o terceiro” logo após sua morte, quando a Unidade 00 se autodestruiu, evento que não conseguia lembrar.

O primeiro Rei aparece morrendo como uma menina nas mãos da Dra. Naoko Akagi ao revelar – ou talvez em trama intencional por Gendo Ikari – para Naoko que Gendou a chamou de “velha bruxa inútil”. A explicação é que sua alma e a maioria das memórias são transferidas para um dos clones toda vez que ela morre, fazendo com que o novo Rei assuma o lugar do anterior como se ele nunca tivesse partido.