Rei Ayanami é a primeira filha de Gendo e piloto da Unidade Evangelion 00. Socialmente retraída, raramente interage com quem lhe rodeia. Sua personalidade fria, silenciosa e emocionalmente abalada faz com que seja desprezada pelos colegas de escola; Asuka costuma chamá‑la de “bonequinha”. Embora esteja vinculada quase exclusivamente a Gendo, ela e Shinji conseguem quebrar o gelo após a batalha contra Ramiel, aproximando‑se progressivamente por algum tempo.

Os clones dela, desprovidos de alma, são mantidos escondidos sob o prédio da NERV como supostos “núcleos” das Plugs Dummy. Há indícios de que Rei morreu duas vezes na série: após sua morte, quando a Unidade 00 se autodestruiu, ela não conseguia lembrar do ocorrido. O primeiro Rei é mostrado morrendo como uma menina nas mãos do Dr. Naoko Akagi, ao revelar – talvez acidentalmente ou em trama intencional de Gendo – que o próprio Gendou a chamava de “velha bruxa inútil”. A explicação é que sua alma e a maior parte das memórias são transferidas para um dos clones toda vez que ela morre; assim, o clone assume o lugar do Rei anterior como se ele nunca tivesse deixado.