Rei Ayanami é a primeira criança criada e piloto da Unidade Evangelion 00. Ela se mostra socialmente retraída e raramente interage com quem lhe rodeia. Sua personalidade fria, silenciosa e emocionalmente abalada atrai o desprezo de seus colegas; Asuka a chama de “bonequinha”. Apesar de estar ligada apenas a Gendo, Rei e Shinji conseguem quebrar o gelo após a batalha contra Ramiel, aproximando‑se gradualmente por algum tempo.

Os clones dela, carecendo de alma, são mantidos escondidos sob o prédio da NERV para atuarem como os supostos “núcleos” das Plugs Dummy. Há indícios de que Rei morre duas vezes na série; isso se baseia no fato de ela afirmar: “Eu acho que sou a terceira”, logo após sua morte quando a Unidade 00 se autodestrói, um evento que ela não consegue recordar.

O primeiro Rei é mostrado morrendo como uma menina nas mãos do Dr. Naoko Akagi depois de revelar, talvez por descuido ou em trama intencional de Gendo, que ele a chamou de “velha bruxa inútil”. A explicação é que sua alma e a maioria das memórias são transferidas para um dos clones sempre que ela morre, permitindo que o novo Rei assuma o lugar do anterior como se nada tivesse acontecido.