Layton recebe uma carta da renomada cantora de ópera Jenis Quatlane, convidando-o para assistir à sua nova apresentação e pedindo ajuda em um mistério envolvendo a morte de Melina há um ano. A própria Melina teria retornado como uma garotinha de sete anos, afirmando ter descoberto o segredo da vida eterna e conhecer todos os segredos que só a verdadeira Melina poderia saber. O caso desperta a curiosidade de Layton e do seu aprendiz Luke, que partem para a casa de ópera Crown Petone; Remi fica em Londres à procura das garotas desaparecidas no local.
A trama se desenrola dentro da história da ópera, que narra o Reino dos Imortais. Antigamente, uma bela rainha apaixonada pela música governava o reino e era adorada por todos. Quando ela adoeceu gravemente, os habitantes buscaram cura, mas a medicina não foi suficiente; a rainha faleceu, e logo depois foi criada uma poção da imortalidade. O povo lamentou profundamente sua perda, e para honrar a rainha, decidiram tornar‑se imortais usando o “naufrágio” da imortalidade. O Reino de Abrosia permanece em algum lugar do mundo, aguardando o retorno da rainha, que então cantará eternamente.
Ao término do espetáculo, um homem mascarado surge e propõe um jogo ao público: o vencedor ganhará vida eterna, enquanto os perdedores deverão morrer. Layton e Luke aceitam o desafio, mergulhando no enigma da Vida Eterna. A história se passa entre os eventos dos videogames Professor Layton and the Last Specter e Professor Layton and the Miracle Mask.
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